제제연구에서 빠질 수 없는 CCK assay

안녕하세요. 약제학(나노 DDS) 박사과정 연구원이자 약사, 똑붕약사예요.

– in vitro cytotoxicity 확인 방법과 원리 정리 제제 연구를 하다 보면 반드시 거쳐야 하는 단계가 있다.

이 제제가 정말 세포를 죽이는가?

독성은 어느 정도인가?

PTT, PDT, Chemo가 시너지 효과를 내는가?

이 질문에 가장 기본이 되는 실험이 바로 CCK assay다. 나 역시 나노입자 기반 제제를 연구하면서 제제의 물성체크 후에, 세포독성 세포 내 약의 효능 등을 평가하기 위해 가장 먼저 간단히 할 수 있는 것이 바로 CCK-8 kit 였다.

1. CCK assay의 핵심 원리

CCK-8의 주성분은 WST-8 (water-soluble tetrazolium salt) 이다.

• 살아있는 세포의 미토콘드리아 환원능을 측정하는 것

살아있는 세포 안에는 NADH, NADPH 같은 환원력을 가진 분자들이 존재한다. (환원력은 전자를 주는 능력, 환원력이 있다 라고 하면, 전자를 준다고 생각하면 된다) 특히 미토콘드리아의 탈수소효소(dehydrogenase)가 활발히 작동한다. 이 효소들이 WST-8을 환원시키면, WST-8 (무색) → Formazan (주황색) 으로 변환된다. 즉, 살아있는 세포가 많을수록 환원 반응이 많이 일어나고

색이 진해지며 Absorbance 값이 증가한다. Radu, Nicoleta & Salageanu, Aurora & Ferdes, Mariana & Rau, Ileana. (2012). Cytotoxicity Study Regarding Some Products Derived from Monascus sp. Molecular Crystals and Liquid Crystals - MOL CRYST LIQUID CRYST. 555. 189-194. 10.1080/15421406.2012.635533.

2. 화학적 관점 – Tetrazolium 환원 반응

WST-8은 tetrazolium salt 계열이다. Tetrazolium 구조는 전자를 받으면 formazan 구조로 변환된다. Tetrazolium (oxidized) ↓ 환원 Formazan (reduced, colored) 세포 내 전자전달계의 환원 환경을 반영한다는 점이 중요하다. 그래서 CCK assay는 “세포 수”를 재는 것이 아니라

• 세포의 대사활성(metabolic activity) 을 측정하는 assay다.

3. 측정 원리 – 분광학적 분석

생성된 formazan은 450 nm 에서 강한 흡광을 보인다. Microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하면, Absorbance (450 nm) ∝ 살아있는 세포 수 이 관계를 이용해 다음을 계산할 수 있다. 세포 생존율 (cell viability) IC50 약물 독성 평가 제제연구에서 기본이 되는 데이터다. http://seo.selleckchem.com/bioreagents/cell-counting-kit-8.

4. 실험 방법 (In vitro cytotoxicity protocol)

실제 실험은 다음 순서로 진행된다. 96-well plate seeding 후 24 h 안정화 약물/나노입자 처리 후 24 h incubation PBS(또는 배지)로 washing 후 fresh media로 교체 레이저 군은 이 시점에 irradiation (PTT/PDT 조건) 24 h 추가 incubation 각 well에 CCK-8 reagent를 최종부피의 10%가 되도록 첨가 37°C에서 4 h 반응 (세포주에 따라 최적화)

450 nm 흡광도 측정 (+ blank 보정)

5. MTT와의 차이점

항목 MTT CCK-8 생성물 불용성 formazan 수용성 formazan 용해 과정 DMSO 필요 바로 측정 독성 비교적 있음 낮음 민감도 보통 높음 Cell cytotoxicity를 보기에 MTT assay도 많이 사용한다. 비교를 해보았다. CCK는 washing, 용해 과정이 필요 없다. 그래서 나노입자 실험에서 훨씬 간편하다. 특히 제제연구에서는 세포를 최대한 교란하지 않는 조건이 중요하다.

6. 약제학적 해석 – 주의할 점

CCK는 “세포의 대사활성”을 측정한다는 점. 그래서 이런 경우 해석에 주의해야 한다. 미토콘드리아 기능만 저하되어도 absorbance 감소 세포가 살아있지만 metabolic suppression 상태일 수 있음 ROS가 많은 PDT 실험에서는 과장된 독성처럼 보일 수 있음 PDT에서 생성된 ROS는 미토콘드리아 대사활성을 먼저 붕괴시키기 때문에, CCK는 실제 세포 사멸보다 더 빠르고 크게 감소하여 독성이 과장되어 보일 수 있다.

CCK 원리를 설명하는 글을 쓰겠다고 해놓고 해가 지나가서, 이제서야 올려본다.

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